Шта је култура ћелија?
ћелијска култура
Ћелијска култура се односи на процес раста ћелија у контролисаним условима ван њиховог природног окружења. То је ин витро алат који олакшава разумевање ћелијске биологије и механизама болести. Такође игра улогу у откривању лекова, као што су тестирање токсичности лекова и фармакокинетичке/фармакодинамичке студије, као и персонализована медицина.
Амерички ембриолог Рос Гранвил Харисон развио је прве технике културе ћелија ин витро почетком 20. века, када је успешно узгајао фрагменте ткива из ембриона жаба ин витро. Данас је култура ћелија помогла безбројним открићима, као што је развој вакцина против дечије парализе, малих богиња, заушњака и других заразних болести.
Култура адхезије и суспензије
Постоје два основна система за раст ћелија: адхерентна култура и култура суспензије. Адхерентне културе се узгајају на вештачким супстратима, док ћелије у суспензијским културама слободно лебде у медијуму. Док само неколико типова ћелија природно расте у суспензији (нпр. лимфоцити), многи адхерентни типови ћелија могу се прилагодити култури суспензије.
Постоје два разлога за култивисање природно везаних ћелија у суспензији. Прва предност суспензије културе је та што се ћелије лакше пролазе јер не морате ензимски или механички да их одвојите од посуде за културу. Друго, суспензијске културе је лакше повећати јер је раст ћелија ограничен само њиховом концентрацијом у медијуму, а не доступном површином. Главни недостатак суспензијских култура је тај што захтевају дневни број ћелија и тестове одрживости да би пратили обрасце раста, док се прилепљене културе могу лако испитати под микроскопом.
2Д и 3Д методе
Адхерентне културе се даље могу поделити на 2Д и 3Д културе. У 2Д апликацијама, адхерентне ћелије се узгајају у једнослојном систему на равној површини, као што је у боци за ћелијску културу.
ћелијска култура
Због своје једноставности, 2Д технологија не може да опонаша ин виво окружење ћелија, које обично расту у тродимензионалним структурама са сложеним интеракцијама ћелија-ћелија. Због тога се неки експерименти изводе коришћењем 3Д култура које се могу узгајати коришћењем технологија заснованих на скелама или без скела.
3Д методе засноване на скелама обично укључују раст адхерентних ћелија у хидрогел скелама. Алтернативе као што су биокерамичке, металне или полимерне скеле се такође користе за неке примене.
Технике без скела користе се за узгој сфероида помоћу једне од три различите методе:
Принудно плутање: Убаците ћелијску суспензију у отворе микроплоче са ниским пријањањем. Микроплоча се затим центрифугира да би се ћелије натерале да формирају сфероиде.
Висећа капљица: ћелијска суспензија се убацује у бунарчиће висеће капљице. Као што име каже, суспензија ће висити на плочи као капљице. Ћелије ће се агрегирати на врховима ових капљица и формирати сфере.
На бази мешања: ћелијска суспензија се ставља у ротирајући биореактор. Услед сталног мешања, ћелије нису могле да се залепе за зидове, формирајући тако сфероиде.
Изазов ћелијске културе
Упркос разликама у методама и техникама, сви експерименти имају једну заједничку ствар: тешко је узгајати живе ћелије у потребном броју да би се добили поновљиви резултати. Стога ће наредни одељци бити посвећени четири изазова – поновљивости, контаминацији, изводљивости и преласку на аутоматизацију.
репродуктивност
Према истраживању Ионгиуе Медицал, више од 70 одсто научника је изјавило да нису успели да репродукују експерименте другог научника, а више од половине није успело да репродукује сопствени рад. У тестовима ћелијске културе, већина проблема са репродуктивношћу произилази из биолошких разлика између ћелијских пролаза или генерација. Други велики проблем је погрешна идентификација ћелијских линија, а недоследности у параметрима културе такође играју важну улогу.
биолошка варијација
Фактори као што су случајне мутације или грешке у транскрипцији имају потенцијал да утичу на поновљивост експеримената сваки пут када се ћелија дели. Да бисте то избегли, требало би да креирате банку ћелија на почетку новог пројекта.
банка ћелија
Банкарство ћелија се односи на процес складиштења серија специфичних типова ћелија за каснију употребу како би се избегли фактори као што су насумичне мутације или грешке у транскрипцији које утичу на поновљивост. Први корак је успостављање главне банке ћелија (МБЦ) узгајањем одабраних типова ћелија од интереса за културу и њихово криопрезервирање у више контејнера. МБЦ серије се одмрзавају и касније користе за припрему радних банака ћелија (ВБЦ).
Погрешна идентификација ћелијских линија
Проблем погрешне идентификације ћелијске линије је познат од 1960-их, када је научник описао контаминацију ХеЛа ћелија 19 других људских ћелијских линија. Да бисте били сигурни да су ваши резултати поуздани и, што је још важније, да не доносите лажне закључке, требало би да ставите у карантин све нове ћелијске линије које улазе у лабораторију док се не потврди њихово порекло. Оно што је најважније, препоручује се поновити квалификацију ћелијске линије пре криопрезервације и дистрибуције у друге лабораторије и након што је пројекат завршен. Да бисте верификовали ћелијску линију, прво треба да проверите да ли је наведена у регистру погрешно идентификованих ћелијских линија. Ако није регистрован, још увек морате да потврдите његову аутентичност. За људске ћелијске линије препоручује се анализа кратких тандем понављања (СТР) (ДНК отисак прста). Доступне су различите методе тестирања за не-хумане ћелијске линије, укључујући кариотипизацију, анализу изоензима и типизацију митохондријалне ДНК (ДНК баркодирање).
Параметри културе
Трећи фактор који утиче на репродуктивност су параметри културе.
На пример, нивои кисеоника могу значајно утицати на култивисане ћелије. Међутим, варијабле које утичу на оксигенацију, као што су величина коморе или густина ћелија, нису увек документоване и стога се не могу одржавати доследним.
Други важан параметар културе је медијум. Ово обезбеђује неопходне хранљиве материје, факторе раста и хормоне и регулише пХ и осмотски притисак. Стога је најважније да је његов састав увек исти. Ово је посебно критично за средње формулације допуњене феталним говеђим серумом (ФБС), чији састав зависи од фактора као што су исхрана краве, географска локација и доба године. Да бисте минимизирали ефекат ФБС-а на поновљивост резултата, требало би да наручите различите серије серума када тренутне залихе почну да се смањују и тестирајте их да бисте пронашли најближе подударање. Да би други могли да репродукују ваше резултате, требало би да пријавите како сте прегледали серум и забележите број серије.
ћелијска култура
Обрада ћелија
Већина истраживача зна да параметри културе имају огроман утицај на њихову примену, али промене у техникама обраде се често занемарују.
Загађење
Када се ћелије изолују из ткива и узгајају у лабораторији, оне више нису заштићене имуним системом и стога су изузетно осетљиве на контаминацију.
Први извор контаминације су абиотски загађивачи као што су нечистоће у медијуму културе, серуму, суплементима или води, као и ендотоксини и средства за испирање. Мере предострожности укључују употребу воде лабораторијског квалитета за експерименте са ћелијском културом и медијума, серума, суплемената и потрошног материјала од произвођача који нуде сертификат за тестирање ендотоксина. Поред тога, потрошни материјал мора бити направљен од чистог полистирена или полипропилена како би се осигурало да пластични адитиви не уђу у вашу ћелијску културу.
Други извор контаминације су биолошки загађивачи као што су бактерије (укључујући микоплазму), гљиве и квасац.
изводљивост
Вијабилност ћелије се дефинише као пропорција живих ћелија у узорку. Поред загађивача које смо управо видели, постоје разни други фактори који утичу на одрживост ћелија. Услови околине—температура, пХ, осмотски притисак, доступност хранљивих материја и концентрације О2 и ЦО2— су веома важни. Већина ових варијабли контролише медијум и специфичне су за тип ћелије, што нажалост значи да не можемо да дамо конкретне смернице.
Пошто су ћелије веома осетљиве на притисак, треба обратити пажњу не само на услове околине, већ и на своје технике руковања течностима.
Последњи фактор који утиче на виталност ћелије је старење. Већина коначних ћелијских линија преживи 20 до 60 подела пре него што умре, што значи да се могу поново користити само између 15 и 45 генерација. Након тога, криоконзервирани узорак треба да се одмрзне из банке ћелија. Непрекидне ћелијске линије могу да се размножавају неограничено, али пошто су склоне генетском одласку, треба их редовно заменити.
Тестови детекције помоћу колориметријских, флуорометријских и биолуминисцентних метода могу се користити за мерење виталности ћелија. Често коришћена колориметријска метода је МТТ метода, која се заснива на редукцији жутих тетразолијумових соли у љубичасте кристале формазана од стране живих ћелија.
96-плоче за бунаре
аутоматизација
Многи од горе описаних изазова могу се решити аутоматизацијом радних токова у култури ћелија. На пример, руковање ћелијама ће увек бити доследно, што ће позитивно утицати на поновљивост и одрживост. Што је најважније, аутоматизација смањује ризик од контаминације корисника.
Упркос овим предностима, аутоматизација читавих токова посла може бити изазовна због буџетских разлога, недостатка простора за роботе или зато што нема довољно ресурса за аутоматизацију и валидацију сваког корака одједном. Али ово се може решити!
