Ћелијска култура је један од најважнијих алата који се користе у ћелијској и молекуларној биологији, пружајући одличан модел система за проучавање нормалне физиологије и биохемије (нпр. метаболичке студије, старење), ефеката лекова и токсичних једињења на ћелије, као и ефеката ћелијске мутагенезе и канцерогенезе. Такође се користи у скринингу и развоју лекова, иу великој производњи биолошких једињења (нпр. вакцине, терапеутски протеини). Главна предност коришћења ћелијске културе за било коју од ових примена је конзистентност и поновљивост резултата који се могу добити коришћењем серије клоналних ћелија.
ћелијска култура
Ћелијска култура се односи на уклањање ћелија са животиња или биљака и њихов раст у повољном вештачком окружењу. Ћелије се могу уклонити директно из ткива и ензимски или механички дисоцирати пре културе, или могу бити изведене из успостављених ћелијских линија или сојева
1. Примарна обука
Примарна култура се односи на фазу културе након што су ћелије изоловане из ткива и размножене под одговарајућим условима док не заузму сав расположиви супстрат (тј. дођу до конфлуенције). У овој фази, ћелије се морају субкултурисати (тј. пасирати) пребацујући их у нови контејнер са свежим медијумом за раст како би се обезбедило више простора за наставак раста.
2. Ћелијске линије
Након прве субкултуре, примарне културе се називају ћелијске линије или субклонови. Ћелијске линије изведене из примарних култура имају коначан животни век (тј. оне су ограничене) и када се пасирају, ћелије са највећим потенцијалом раста преовлађују, што резултира степеном генотипске и фенотипске униформности у полу популације.
3. Ћелијске линије
Ћелијска линија постаје ћелијски сој ако се субпопулација ћелијске линије активно бира из културе клонирањем или другим методама. Ћелијске линије често добијају додатне генетске промене након покретања родитељске линије.
4. Ограничене ћелијске линије и континуиране ћелијске линије
Нормалне ћелије се обично деле само ограничен број пута пре него што изгубе своју способност размножавања, што је генетски условљен догађај који се зове старење; ове ћелијске линије се називају коначним. Међутим, неке ћелијске линије постају бесмртне кроз процес који се зове трансформација, који се може десити спонтано или индукован хемијски или вирусно. Коначна ћелијска линија постаје непрекидна ћелијска линија када се подвргне трансформацији и стекне способност бесконачне дељења.
Континуирано култивисане ћелијске линије су склоне генетском померању, коначне ћелијске линије су осуђене на старење, све ћелијске културе су подложне микробној контаминацији, а квар опреме може доћи чак иу најбоље вођеним лабораторијама. Пошто су успостављене ћелијске линије вредан ресурс чија је замена скупа и дуготрајна, од суштинске је важности да се криоконзервирају за дуготрајно складиштење.
Када се из субкултуре добије мали број преосталих ћелија, треба их замрзнути као залихе семена и заштитити од опште лабораторијске употребе. Радне залихе се могу припремити и допунити из замрзнутих залиха семена. Ако је залиха семена исцрпљена, тада криоконзервирана радна залиха може да се користи као извор за припрему свежег семена, чиме се постиже минимално повећање количине од почетног замрзавања.
Најбољи начин за криоконзервацију култивисаних ћелија је у течном азоту, у комплетној средини, у присуству криопротектаната као што су диметил сулфоксид (ДМСО) или глицерол. Криопротектори снижавају тачку смрзавања медијума и такође смањују брзину хлађења, значајно смањујући ризик од формирања кристала леда, који могу оштетити ћелије и довести до ћелијске смрти.
Познато је да ДМСО олакшава улазак органских молекула у ткива. Приликом руковања реагенсима који садрже диметил сулфоксид, треба користити опрему и поступке који одговарају опасностима овог материјала. Одложите реагенсе у складу са локалним прописима.
Узгајати ћелије из замрзнутих радних ћелија
Обавезно попуните дневник мобилног банкарства
Одредите број пролаза, нпр. ако су претходне ћелије замрзнуте и одмрзнуте три пута, процес одмрзавања би био четврти пролаз.
Додајте медијум за раст (минимални медијум, телећи серум и антибиотици) у Т75 боце означене ћелијском линијом, бројем пасуса и датумом
Поставите балон хоризонтално у ЦО инкубатор на 37 степени и 5 процената ЦО најмање 15 минута. Ово ће загрејати медијум и довести га до нормалног пХ (7.0-7.6)
Одмрзните замрзнуте бочице са ћелијским линијама у воденом купатилу на 37 степени уз лагано мешање. Да бисте смањили ризик од контаминације, држите о-прстен и поклопац изнад нивоа воде (2-5 минута).
Ставите бочицу у биолошки сигурносни ормарић (БСЛ-2). Да бисте избегли контаминацију, обришите са 70% етанола пре отварања бочице.
Пренесите садржај бочице са замрзнутим ћелијама у боцу Т75 која садржи медијум за раст. Промешајте и лагано протресите боцу да равномерно распоредите ћелије по површини боце.
Инкубирајте боцу преко ноћи у ЦО2 инкубатору на 37 степени са 5 процената ЦО2. Дозволите ћелијама да се прикаче преко ноћи
променљиви медиј раста
Инкубирајте боцу додатних 2-4 дана на 37 степени, 5 процената ЦО2 и пратите док ћелије не расту
Када ћелије достигну приближно 90 процената конфлуентности, ћелијски фонд се може проширити помоћу Т150 боце