Када сте тек дипломирали и ушли у посао, суочени сте са гомилом именица које се суочавају са квантитативним ПЦР експериментима у реалном времену. Да ли сте збуњени око тога одакле да почнете? Шта је значење криве појачања, стандардне криве, прага, ЦТ вредности, криве топљења и основне линије? Флуоресцентне слике из тих експеримената су превише светле, али изгледа да не могу да их идентификујем. Данас ћемо вас одвести да научите ова знања и концепте у два дела: технички термини и често постављана питања.
Део И Стручни услови
1. Крива појачања
Крива амплификације се односи на криву где је број циклуса апсциса, а интензитет флуоресценције у реалном времену током реакције је ордината током ПЦР.
2. Баселине
Основна линија се односи на малу промену флуоресцентног сигнала током првих неколико циклуса реакције ПЦР амплификације. Ниво сигнала је близу праве линије, што је основна линија.
3. Подешавање прага флуоресценције
Типично, сигнал флуоресценције првих 15 циклуса ПЦР реакције се користи као позадински сигнал флуоресценције, а праг флуоресценције је 10 пута већи од стандардне девијације сигнала флуоресценције током 3-15 циклуса ПЦР, а праг флуоресценције се поставља током експоненцијалне фазе ПЦР амплификације. Типично, сваки инструмент има свој праг флуоресценције пре употребе.
4. ЦТ вредност
ЦТ вредност представља број циклуса који ће се десити за сваку ПЦР реакциону епрувету када флуоресцентни сигнал достигне постављени праг. Из истраживања знамо да постоји линеарна веза између ЦТ вредности сваког шаблона и логаритма почетног броја копије тог шаблона. Што је већи почетни број копије, то је мања ЦТ вредност, и обрнуто. Користећи стандарде са познатим почетним бројевима копија, може се направити калибрациона крива где апсциса представља логаритам почетног броја копија, док ордината представља ЦТ вредност. Стога, све док се добије ЦТ вредност непознатог узорка, почетни број копије узорка може се израчунати из стандардне криве.
знате више
Постоји неколико индикатора да се процени да ли је крива појачања добра или не:
Одговор: Тачка прегиба криве је очигледна, посебно је очигледна експоненцијална фаза узорка мале тешке фракције, укупни паралелизам криве појачања је веома добар, основна линија је равна, нема појаве пораста, а појачање крива узорка експоненцијалне фазе концентрације ниског нивоа је веома добра. очигледан.
Б: Нагиб експоненцијалне фазе криве је директно пропорционалан ефикасности појачања, што је већи нагиб, то је већа ефикасност појачања.
Ц: Стандардна основна линија је равна или благо опадајућа, без очигледног узлазног тренда.
Д: Паралелизам кривих појачања за сваку епрувету је добар, што указује да је ефикасност амплификације сваке реакционе цеви слична.
5. Крива топљења
Када се ПЦР производ загреје, како температура расте, дволанчани производ амплификације се постепено дисоцира, што резултира смањењем интензитета флуоресценције. Када се постигне одређена температура, велика количина производа се одваја, што резултира наглим смањењем флуоресценције. Коришћење ове функције заједно са различитим вредностима ТМ за различите ПЦР производе такође се разликује по температури на којој флуоресцентни сигнал брзо опада, што може бити добар начин да се идентификује ПЦР специфичност.
6. Крива топљења (користећи логаритамску криву)
График пикова је формиран логаритмом криве топљења да би се интуитивније приказала ситуација фрагмената производа. Пошто је температура топљења ТМ вредност фрагмента ДНК, могу се одредити одређени параметри који утичу на вредност ТМ фрагмента ДНК, као што су величина фрагмента, садржај ГЦ, итд. Генерално, према нашем принципу дизајна прајмера, обично се каже да је дужина појачаног производа у опсегу од 80-300бп, а температура топљења треба да буде између 80 и 90 степени.
О: Ако постоји само један главни врх између 80 степени и 90 степени, то значи да је ПЦР у реалном времену савршен.
Б: Ако се главни врх појави између 80 степени и 90 степени, а врх нечистоће испод 80 степени, у основи се узима у обзир прајмер-димер. Ово је добра опција за покушај решавања подизањем температуре жарења.
Ц: Ако се главни врх појави између 80 степени и 90 степени, а лутајући врх се појави када се температура повећа, контаминација ДНК се у основи разматра. А ДНК треба уклонити у почетним фазама експеримента.
7. Стандардна крива линија
Стандардни стандарди су разблажени до различитих концентрација и коришћени као шаблони за ПЦР реакције. Стандардна крива је исцртана са логаритмом стандардног броја копије као апсцисе и измереном ЦТ вредношћу као ординатом. Када се квантификује непознати узорак, број копије узорка може се добити из стандардне криве на основу ЦТ вредности непознатог узорка. Стандардне криве су веома важне за апсолутну квантификацију.
други део. заједнички проблем
П1: Која је разлика између РТ-ПЦР, КПЦР, ПЦР у реалном времену и РТ-ПЦР у реалном времену?
А1: РТ-ПЦР је ПЦР са реверзном транскрипцијом, која је широко коришћена варијанта ланчане реакције полимеразе. У РТ-ПЦР-у, ланац РНК се реверзно транскрибује у комплементарну ДНК, која се затим користи као шаблон за ПЦР за амплификацију ДНК помоћу ПЦР-а.
ПЦР у реалном времену и КПЦР су иста ствар, оба су квантитативни ПЦР у реалном времену, што значи да постоји снимање података у реалном времену у сваком циклусу током ПЦР процеса. На овај начин се може прецизно анализирати број стартуп шаблона.
Иако се чини да су и ПЦР у реалном времену и ПЦР са реверзном транскрипцијом скраћени као РТ-ПЦР, међународна конвенција је да се РТ-ПЦР посебно односи на ПЦР са реверзном транскрипцијом, док се ПЦР у реалном времену често скраћује као кПЦР (Куантитативе Реал- Труе Реал-Труе Реал ПЦР ) - временска ПЦР).
РТ-ПЦР у реалном времену (РТ-КПЦР) је тип ПЦР реверзне транскрипције који комбинује флуоресцентне квантитативне технике: прва реверзна транскрипција са РНК да би се добила цДНК (РТ), а затим следи квантитативна анализа помоћу ПЦР у реалном времену (КПЦР).
П2: Зашто је дужина амплификованог фрагмента производа флуоресцентног квантитативног ПЦР-а контролисана у опсегу од 80-300бп?
А2: Дужина сваке секвенце гена је различита, неке од њих су неколико Кб и стотине БП. Међутим, када дизајнирамо прајмер, потребно је само да захтевамо да дужина производа буде 80-300бп, а прекратка или предугачка није погодна за квантитативну ПЦР детекцију.
Фрагменти производа су прекратки да би се разликовали од прајмера-димера. Дужина прајмер-димера је око 30-40бп, када је мања од 80бп, тешко је разликовати да ли је прајмер-димер или производ. Ако је фрагмент производа предугачак и прелази 300 бп, то ће лако довести до ниске ефикасности амплификације, а количина гена се не може ефикасно детектовати.
На пример, када бројите број људи у учионици, потребно је само да избројите колико има уста. Исто важи и за тестирање гена. Потребно је само да откријете одређену секвенцу гена да бисте представили цео низ. Лако је погрешити ако бројите и уста и нос, уши и наочаре да бисте пребројали људе.
П3: Која је оптимална дужина за дизајн прајмера?
О3: Уопштено говорећи, дужине прајмера у опсегу од 20-24бп су добре. Наравно, приликом пројектовања прајмера морамо обратити пажњу на ТМ вредност прајмера, јер је она везана за оптималну температуру жарења. После много експеримената, доказано је да је 60 степени добра ТМ вредност. Ниска температура жарења може лако довести до неспецифичног појачања, док висока температура жарења обично доводи до ниске ефикасности појачања, касног врха криве појачања и одложене ЦТ вредности.
Питање 4: Да ли количина прикупљеног узорка утиче на експерименталне резултате?
А4: Не. Очигледно, што се више узорака сакупи, више се екстрахује РНК, више цДНК и више циљних фрагмената ће бити. За апсолутну квантификацију, потребно је израчунати број копија циљног фрагмента, а количина прикупљеног узорка ће дефинитивно утицати на експерименталне резултате. На пример, откривање ХБВ вируса хепатитиса Ц у крви је откривање садржаја ХБВ у одређеној количини (1 мл) крви.
За релативну квантификацију која се обично користи у научним истраживањима, број узорака нема никакве везе са експерименталним резултатима, јер се релативна квантификација односи на поређење између циљног гена и референтног гена. Само вас молимо да их сматрате узводним и низводним фрагментима присутним у истом ланцу нуклеинске киселине. Ако је величина узорка велика, и референтни и циљни гени се истовремено повећавају у једнаким размерама, што не утиче на резултате.
П5: Да ли ће ефикасност реверзне транскриптазе утицати на експерименталне резултате?
А5: Исто као горе. Имајте на уму да желимо већу РТ ефикасност, али преферирамо да РТ ензим буде релативно стабилан и да добије уједначене резултате. Ово ће бити тест оптимизованих могућности пакета за реверзну транскрипцију великих компанија.
Питање 6: Да ли ефикасност ТАК ензима утиче на експерименталне резултате?
А6: Ефикасност ТАК ензима је релативно велика. Обично су потребни так ензими са врућим стартом и релативно су ефикасни. За комерцијалне квантитативне комплете за флуоресценцију, сваки произвођач ће оптимизовати ефикасност најбољег стања према сопственим производима близу 100 процената, ако је ефикасност прениска, експериментални резултати се не могу добити. За производе различитих компанија ово је мера квалитета.
Питање 7: Да ли количина флуоресцентне боје утиче на експерименталне резултате?
А7: Да, хоће. Ако је флуорохром превише засићен, може изазвати сметње у буци у неким инструментима. Ако флуорохром није засићен, а вредност флуоресценције је прениска, рано ће ући у плато фазу и крива појачања ће бити равна. У квантитативном експерименту флуоресценције углавном се види ЦТ вредност, тако да није битно да касна крива амплификације уђе у стадијум платоа, али слика није довољно лепа. Ако сте морали да бирате, почните са одабиром флуорохрома који је нешто мање засићен. Међутим, када се користи исти производ исте компаније, његов ефекат је у основи занемарљив.
Питање 8: Да ли ће пренос ПЦР епрувете утицати на експерименталне резултате?
О8: Да. Међутим, за исту серију потрошног материјала истог произвођача, овај ефекат се може занемарити. Ово је добар избор и најбоље је да користите 96-плочу са мембраном високе пропустљивости да бисте минимизирали ефекат пропусности светлости потрошног материјала.
П9: Да ли ће грешке током рада утицати на експерименталне резултате?
А9: Утицај процеса рада се углавном огледа у униформности. Хомогеност значи да су све компоненте у систему равномерно помешане заједно, а флеш центрифугирање може решити овај проблем. Поред тога, за почетнике је најбоље прилагодити ПЦР систем да буде већи од 20 инча, а систем који је премали је склонији грешкама. Ако је температура жарења правилно оптимизована, ефекат концентрације прајмера на ЦТ је минимизиран. И знаћете да се неке грешке у раду (као што је концентрација прајмера) могу избећи оптимизацијом температуре жарења.
Резимирати
Горе су нека питања и питања са којима се почетници често сусрећу током експеримента, надамо се да ће вам ова питања помоћи да решите неку забуну. Експериментисање је процес стварања хаоса и решавања проблема, надамо се да ћете нешто извући из тога. Хвала на читању и видимо се следећи пут!