1. У плочицу за културу, натопите стакалце на које се пење са ПБС три пута по 3 минута сваки пут.
2. Поправите плочице са 4 процента параформалдехида на 15 минута, и потопите плочице у ПБС 3 пута, сваки пут по 3 минута.
3. Пермеабилизујте са 0.5 процената Тритон Кс-100 (припремљен у ПБС) 20 минута на собној температури (за антигене експримиране на ћелијској мембрани, овај корак је изостављен).
4. Блокирање серума: уроните плочице у ПБС 3 пута по 3 мин сваки пут, осушите ПБС упијајућим папиром, додајте нормалан козји серум (под условом да је секундарни извор антитела козји) на плочице и блокирајте на собној температури током 30 мин.
5. Додајте примарно антитело: Упијајте раствор за блокирање упијајућим папиром, немојте прати, додајте довољну количину разблаженог примарног антитела на свако стакло и ставите га у влажну кутију, инкубирајте на 4 степена преко ноћи.
6. Додајте флуоресцентно секундарно антитело: уроните плочице у ПБСТ 3 пута, сваки пут по 3 минута, апсорбујте вишак течности на плочицама упијајућим папиром, додајте разблажено флуоресцентно секундарно антитело у капима, инкубирајте на 20-37 степену 1 х у влажној кутији, потопити у ПБСТ Слице 3 пута, сваки пут 3 мин.
Напомена: Од додавања флуоресцентног секундарног антитела, све наредне кораке треба изводити на тамном месту што је више могуће.
7. Блокирање серума: обришите течност упијајућим папиром, испустите нормалан козји серум на стакло (под условом да је секундарни извор антитела козје) и блокирајте на собној температури 30 минута.
8. Додајте примарно антитело: Упијајте раствор за блокирање упијајућим папиром, немојте прати, а затим у капима додајте разблажено примарно антитело и инкубирајте преко ноћи у влажној кутији од 4 степена у мраку након додавања примарног антитела. (Напомена: врста другог примарног антитела се разликује од врсте првог примарног антитела, као што су миш и зец)
9. Додајте флуоресцентно секундарно антитело: уроните плочице у ПБСТ 3 пута, сваки пут по 3 минута, апсорбујте вишак течности на плочицама упијајућим папиром, додајте разблажено флуоресцентно секундарно антитело у капима, инкубирајте на 20-37 степену 1 х у влажној кутији, потопити у ПБСТ Слице 3 пута, сваки пут по 3 мин. (Напомена: Ако је црвена флуоресценција изабрана за детекцију првог антитела, друго мора да изабере друге боје флуоресценције)
10. Противбојна језгра: ДАПИ је додат у капима и инкубиран у мраку 5 минута, узорци су обојени, а вишак ДАПИ је испран са ПБСТ 5 мин×4 пута.
11. Осушите течност на плочици упијајућим папиром, затворите предмет са течношћу за монтажу која садржи средство за гашење флуоресценције и посматрајте и сакупљајте слике под флуоресцентним микроскопом.
