У постепидемијској ери, термин „тестирање нуклеинске киселине“ свима нам је познат и постао је део нашег свакодневног живота.
Дакле, да ли знате како тестирање нуклеинске киселине открива вирусе? И како тестирање нуклеинске киселине чини невидљиве вирусе „видљивим“?
01 Шта је нуклеинска киселина
Нуклеинска киселина је општи назив за ДНК и РНК.
Нуклеинска киселина је есенцијална компонента свих познатих живота на земљи. ДНК за коју често кажемо да је деоксирибонуклеинска киселина. Генетски материјал новог коронавируса је РНК - рибонуклеинска киселина.
Тестирање амплификације нуклеинске киселине
02 Шта тачно открива тестирање нуклеинске киселине?
Супстанца за детекцију нуклеинске киселине је нуклеинска киселина вируса.
Нови коронавирус је вирус који садржи само РНК, а специфична секвенца РНК у вирусу је маркер који разликује вирус од других патогена. Детекција нуклеинске киселине је да се утврди да ли има нуклеинске киселине страног вируса у респираторном узорку или крви пацијента да би се утврдило да ли је заражен новим коронавирусом. Велика већина тренутне детекције нуклеинске киселине новог коронавируса користи флуоресцентну квантитативну ПЦР методу за амплификацију циљне секвенце вирусне РНК помоћу ПЦР-а након реверзне транскрипције.
ПЦР, или ланчана реакција полимеразе, је техника молекуларне биологије која се користи за амплификацију специфичних фрагмената ДНК; односи се на реакцију специфичних гена катализовану ДНК полимеразом или Реакција брзе ин витро амплификације ДНК секвенци се такође назива генско ин витро појачање. Флуоресцентна квантитативна ПЦР технологија је додавање флуоресцентног репортерског система у ПЦР реакцијски систем и коришћење промене флуоресцентног сигнала за праћење ПЦР процеса у реалном времену, како би се реализовала квантитативна детекција почетног шаблона.
Да би се открила нуклеинска киселина, први корак је сакупљање узорка. Тренутно, најконвенционалнији метод узорковања је: користити брис грла или носне брисеве за брисање и сакупљање горњих дисајних путева (ждрела или носне шупљине); прикупљени узорци ће бити строго запечаћени, а затим послати у лабораторију на постепено испитивање.
1. Екстракција вирусне РНК
РНК вируса се прво екстрахује из узорка. Додајте реагенсе за екстракцију нуклеинске киселине у узорак да бисте уништили вирус и ослободили нуклеинску киселину.
2. "Реверзна транскрипција" вирусне РНК у цДНК
Кроз технологију реверзне транскрипције (РТ), РНК вируса се „преокреће“ у специфичну ДНК која је погоднија за откривање, односно цДНК.
3. Амплификација и детекција цДНК
У ствари, било да је у питању брис грла, брис носа или чак узимање узорака крви, садржај вируса у узорку је релативно низак, чак и код тешко инфицираних пацијената (вирусно оптерећење је велико); јер су честице вируса премале и запремина узорковања ограничена, број вируса садржаних у узорку је и даље премали за детекцију нуклеинске киселине.
Због тога, коришћењем ПЦР технологије, инспектори појачавају јединствену „лозинку“ новог корона вируса у узорку до тачке у којој опрема може да га открије, како би проценили да ли се ради о позитивној инфекцији. Цео процес хватања генетског материјала вируса је као пецање. Удица ће га идентификовати и зграбити, тако да вирус нема где да се сакрије.
Једноставно речено, то је да се повећа број цДНК, тако да се цДНК континуирано реплицира, тако да се број експоненцијално повећава.
Стандардни ПЦР процес је подељен у три корака:
Денатурација: Употреба високе температуре за раздвајање двоструких ланаца ДНК. Водоничне везе између двоструких ланаца ДНК се прекидају на високој температури (93 - 98 степен ).
Жарење: Након што се двоструки ланци ДНК раздвоје, температура се снижава да би се омогућило прајмерима да се вежу за једноланчану ДНК.
Продужетак: ДНК полимераза синтетише комплементарни ланац дуж ланца ДНК од везаног прајмера када се температура спусти. Када је елонгација завршена, један циклус је завршен и број фрагмената ДНК се удвостручује. Поновите ова три корака 25-35 пута и број фрагмената ДНК ће се експоненцијално повећати.
ПЦР дволанчани шаблон
Док се цДНК умножава, флуоресцентне сонде у комплету раде истовремено. Он ће ослободити флуоресцентни сигнал и сваки пут када се цДНК појача, флуоресцентни сигнал ће се мало повећати, а ПЦР детектор може да забележи Цт вредност повећања флуоресцентног сигнала.
Вредност Цт је важан индикатор за процену да ли је нуклеинска киселина вируса негативна или позитивна. Што је мање почетне ДНК, потребно је више ПЦР циклуса да би се достигао одређени праг, а Цт вредност је већа. Насупрот томе, што је више почетне ДНК, то је нижа вредност Цт. Почетна количина ДНК одражава количину вирусне РНК у узорку, што заузврат одражава количину вируса у узорку. Стога, ако вредност Цт није откривена или је виша од одређене вредности, онда се сумњиви пацијент оцењује као негативан; ако је нижа од ове вредности, онда се сумњиви пацијент оцењује као позитиван.
Током ПЦР реакције, избор ПЦР потрошног материјала је такође један од најважнијих фактора који утичу на резултате детекције нуклеинске киселине.
